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京东彩票pk拾计划:文獻解讀 | 環狀RNA VMA21通過靶向調控miR-200c和XIAP防止椎間盤突出

2018-12-21

京东彩票怎么买 www.xgqnxi.com.cn 環狀RNA VMA21通過靶向調控miR-200c和XIAP防止椎間盤突出

摘要

circRNAs可以作為競爭性內源RNA發揮作用與microRNAs(miRNAs)相互作用并影響miRNA靶mRNA的表達。circRNA是否可以作為競爭性內源性RNAs調節椎間盤退變(IVDD)的病理過程有待研究。

方法

在IVDD中,采用自患者的NP細胞(nucleus pulposus Cells,NPc)和退行性NP組織和大鼠模型研究circ-VMA21。研究了circ-VMA21與miR-200c以及其靶基因X連鎖抑制劑 -檢測凋亡蛋白(XIAP)的相互作用。

結果

炎癥細胞因子處理NP細胞抑制XIAP的表達。退行性的NP組織與過度凋亡和細胞外基質的合成代謝因子與分解代謝因子之間的不平衡直接相關。mir-200c通過抑制XIAP調節NP細胞活性和功能。在NP細胞中circ-VMA21充當了miR-200c海綿通過靶向miR-200c和XIAP發揮作用。椎間盤內注射circ-VMA21減輕大鼠模型中的IVDD。

結論

Circ-VMA21可以通過miR-200c-XIAP途徑減輕炎癥因子誘導的NPc凋亡和細胞外基質合成代謝和分解代謝之間的失衡。它提供了一個IVDD可能有效的治療策略。

前言

有充分證據表明腰背部痛是殘疾的主要原因,其主要是由椎間盤(IVD)變性,一種退行性椎間盤的疾病引起的。椎間盤由內核組成髓質(NP)并被纖維環包圍。髓核細胞(NPC)是一類駐留在NP中細胞并負責合成細胞外基質(ECM),例如II型膠原蛋白(膠原蛋白II)和聚集蛋白聚糖。這些蛋白質是IVD保持椎間盤高度和對抗多種外部機械壓縮的要的功能組合物。多種異常刺激可以增加NP中的炎癥因子{例如白細胞介素-1β(IL-1β)和細胞因子)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)},然后誘導NPC的合成代謝和分解代謝之間的不平衡,例如增加分解代謝因子(如基質金屬蛋白酶)(MMP)和去整合素和金屬蛋白酶血小板反應蛋白基序(ADAMTS))和抑制合成代謝因子的表達(如膠原蛋白II和聚集蛋白聚糖),以及過度的NPC凋亡。這些不利因素引發或加速椎間盤突出椎間盤退變(IVDD).因此,有必要找到抑制NPC凋亡的有效方法,減弱炎癥反應,扭轉NP微環境不平衡合成代謝與分解代謝之間的關系。


微小RNA(miRNA)很小,單鏈,非編碼RNA分子,通過直接與靶mRNA的3'非翻譯區(UTR)抑制蛋白的產生。miR-200c通常與各種癌癥有關,通過阻斷上皮細胞向間充質細胞轉變,表現出腫瘤抑制的功能。此外,最近的研究也有揭示其靶向不同的mRNAs誘導細胞凋亡的能力。此外,miRNAs作為調控基因表達在預防和治療IVDD發揮重要作用。


環狀RNA(circRNA)是另一種類型沒有5'-3'極性的環結構和多腺苷酸化的尾巴的RNA。大多數circRNAs是內源性非編碼RNA,不同物種之間的表現更高是保守的,穩定程度比線性mRNAs高,它們主要由一個或多個外顯子通過反向剪切機制形成。雖然circRNAs具體生物發生尚不完全清楚,但通過在側翼內含子序列之間進行配對可以找到了一個可靠的環化驅動模型。例如,互補的Alu重復元素在側翼內含子內促進形成外顯子衍生的circRNAs 最近,一些circRNAs已被證明富含miRNA結合位點,并作為競爭內源RNA(ceRNA)與miRNA相互作用并影響靶mRNA的表達。


到目前為止,尚不清楚circRNA是否可以充當ceRNA來調節NPC活力和功能,以及IVDD的病理過程。在這項研究中,我們鑒定了一種來自VMA21的circRNA(名為Circ-VMA21;也稱為hsa_circ_0091702在NP中的CircBase(http:// www.cirbase.org))并系統地研究了它在細胞和細胞中的作用IVDD的動物模型。


miR-200c在退行性NP組織中上調參與NPC活力和功能的調節

使用來自NCBI的生物技術信息綜合數據庫(GSE45856)研究退行性NP組織中miRNA在的差異表達。通過miRNA芯片技術檢測到2672個miRNA,14種miRNA在退行性NP組織表達上調(圖1A)。使用定量實時逆轉錄PCR分析候選miRNA表達。使用上述標準,觀察到miR-200c,miR-130b-5p和miR-2355-5p在退行性NP組織中顯著上調比較,其中miR-200c具有最高水平的上調(圖1B)。這些miRNA在大鼠模型的表達變化與IVDD患者的表達一致(圖1C)。 Northern印跡也證實了在退行性NP組織中的miR-200c水平(圖1D)。

因此,選擇miR-200c用于進一步分析

進一步研究NPC中過表達miR-200(圖1E)促進細胞凋亡(圖1F),同時caspase活化升高, MMP-3,MMP-13,ADAMTS-4和ADAMTS-5表達升高,并且抑制膠原蛋白II和聚集蛋白聚糖的表達(圖1G)。這些結果表明在NPC中miR-200c具有促凋亡和促進代謝作用。應用TNF-α/IL-1β處理,NPC中miR-200c水平增加,miR-200c拮抗劑可以抑制其水平(圖1H)。TNF-α和IL-1β處理增強細胞凋亡和ECM代謝反應的變化,而抑制miR-200c減弱這種效應(圖1I,J)。因此,功能喪失和失效實驗表明miR-200c是NPC的生存和功能的負面調控因子。

(圖1)

mir-200c通過抑制XIAP調節NPc活力和功能

生物信息學預測結果表明,XIAP是細胞凋亡途徑調節因子,也是miR-200c的潛在靶點(圖2A)。Gene ontology(GO)分析揭示了退行性NP組織中上調的miRNA和細胞凋亡信號通路的調節之間的相關性。熒光報告系統結果表明miR-200c抑制野生型XIAP報告基因活性,而miR-200c對突變的XIAP報告基因活性沒有影響(圖2B)。在退行性NP組織中觀察到XIAP(圖2C)。在NPC中miR-200c水平升高抑制XIAP表達,而內源miR-200c的敲低增加XIAP表達(圖2D)。TNF-α/IL-1β處理抑制NPC中的XIAP蛋白表達,而miR-200c拮抗劑減弱這種效應(圖2E)。此外,我們研究了在NPC中是否miR-200c與XIAP的功能相關。結果顯示XIAP敲低誘導NPC凋亡,加劇了分解代謝反應并降低了ECM的表達。進一步結果表明,敲除XIAP顯著抵消了miR-200c拮抗劑在TNF-α/IL-1β處理NPCs的影響(圖2F,G),表明miR-200c通過XIAP發揮其功能.

(圖2)

Circ-VMA21作為miR-200c的海綿

starBase預測了多個具有miR-200c結合位點的circRNA然后根據評分篩選了前20個circRNA。使用特定的不同引物通過qRT-PCR檢測分析所選擇的circRNAs 在NP樣品中的存在。(圖3A,上圖)然后通過測序進一步確認(圖3A,下圖)。通過qRT-PCR分析表明在退行性NP組織中Circ-VMA21表達水平顯著下調(圖3B)。這個結果也通過RNA熒光原位雜交(FISH)證實(圖3C)。退行性NP組織中Circ-VMA21表達水平與XIAP表達水平呈正相關。

為了研究Circ-VMA21是否可以被miR-200c限制,我們使用RNAhybrid將Circ-VMA21的序列與miR-200c的序列進行比較,并發現Circ-VMA21包含六個miR-200c的結合位點(圖3D)。其中,通過熒光素酶測定驗證了五個位點(圖3E)。該circRNA豐富且對RNase R具有抗性與mRNA相比的治療(圖3F)。 Northern blot analysis顯示線性VMA21可通過線性探針檢測到,但circRNA探針檢測不到環化位點(圖3G)。Pull-down測定揭示了Circ-VMA21富集更多的miR-200c對比破壞了miR-200c與Circ-VMA21結合的突變的miR-200c(圖3H)。 Circ-VMA21源自VMA21基因的最后一個外顯子,主要轉錄mRNA的3'UTR。CircInteractome表明其擁有69個Argonaute 2(AGO2)蛋白質的結合位點。交聯和免疫沉淀(CLIP)序列顯示至少30個AGO2結合區位于VMA21 mRNA的3'UTR。其中,五個區域與miR-200c結合位點重疊(圖3I,上圖)。結果表明AGO2免疫沉淀內源性Circ-VMA21,用AGO2拉下來了富含轉染miR-200c而不是其突變體(圖3I),表明miR-200c促進了AGO2和Circ-VMA21之間的結合。 Northern印跡分析顯示miR-200c反向pull-down可以獲得Circ-VMA21(圖3J)。 RNA FISH發現Circ-VMA21和miR-200c在NPC的細胞質中共定位(圖3K)。我們的結果表明NPC中Circ-VMA21能夠直接結合的miR-200c。

(圖3)

Circ-VMA21通過靶向mir-200c和XIAP調控NPC功能

采用被攜帶Circ-VMA21、線性VMA21腺病毒,以及Circ-VMA21 siRNA或對照siRNA感染NPC。 qRT-PCR的結果顯示感染腺病毒Circ-VMA21導致NPC中過表達Circ-VMA21和siRNA抑制Circ-VMA21表達(圖4A)。敲除VMA21 mRNA沒有影響Circ-VMA21水平。同樣,Circ-VMA21 siRNA對mRNA表達沒有影響。 Northern blot anal-ysis也證實了攝入外源性Circ-VMA21之后Circ-VMA21的表達升高(圖4B)。然后,通過蛋白質印跡檢測Circ-VMA21對XIAP表達的影響。 Circ-VMA21的上調增加了XIAP表達,而Circ-VMA21敲低減少XIAP表達(圖4C)。對Circ-VMA21的上調抵消了miR-200c對XIAP表達的抑制作用(圖4D)和啟動子活性(圖4E)。這些在一起結果表明Circ-VMA21充當功能性海綿miR-200c調節XIAP表達和啟動子活性。接下來,我們研究了Circ-VMA21在TNF-α/IL-1β處理過的NPC功能。炎癥因子處理后,qRT-PCR分析發現Circ-VMA21減少和miR-200c水平的增加,這可以通過對Circ-VMA21的上調來扭轉(圖4F,G)。結果表明,過表達Circ-VMA21抑制了細胞凋亡和分解代謝的作用,促進了膠原蛋白II和II的表達、聚集了蛋白聚糖(圖4H,I)。此外,我們探討了XIAP是炎癥因子處理的NPC中Circ-VMA21的下游基因。我們共同轉染了Circ-VMA21和XIAP siRNA,并觀察到Circ-VMA21對NPC活力和功能的影響減弱了(圖4J,K)。這些數據表明Circ-VMA21通過靶向mir-200c和XIAP調控NPC功能。

(圖4)

椎間盤內注射Circ-VMA21腺病毒減輕了大鼠的IVdd 

我們通過針穿刺成功建立了IVDD大鼠模型(圖5A)。在穿刺后1周和5周,使用33號細針將人腺病毒Circ-VMA21注射到IVD。在所有IVD穿刺組中,X射線處理1,5和9周顯示進行性椎間盤間隙隨著時間的推移縮小范圍。在Circ-VMA21組和非注射或Circ-VMA21-mut組中每一個注射后的時間點,椎間盤高度指數的百分比(%)記錄無明顯差異(圖5B,C)。注射 9周后,IVD的MRI變性評分Circ-VMA21組明顯低于非注射組(圖5D,E,)。體內RNA FISH發現Circ-VMA21位于NP區域(圖5F)。之后注射腺病毒Circ-VMA21,cirvMA21水平在退行性NP組織顯著升高,而miR-200c的水平降低(圖5G,H)。注射腺病毒Circ-VMA21減輕了NP的退行性變化。諸如增強的凋亡和分解代謝反應,在IVDD大鼠模型中減少ECM組成(圖5I,J,K)。 非注射組的邏輯評分比9周時的Circ-VMA21組顯著更高(圖5L,M)。

總之,這些結果揭示了Circ-VMA21水平升高的積極作用,減弱NPC凋亡,抑制ECM分解代謝,促進NP中的合成代謝和在體內緩解IVDD結果。

(圖5)

總結

多個證據表明某些miRNA可以針對與發育有關的不同基因參與IVDD的進展,并在調節NPC活力和功能方面發揮重要作用。在這項研究中,首先確定了miR-200c是參與IVDD的關鍵miRNA。 miR-200c參加了促凋亡反應和合成代謝和分解代謝因子不平衡表達。然后調查潛在影響NPC中的miR-200c的circRNAs。結果顯示Circ-VMA21通過捕獲miR-200c來顯著降低miR-200c的活性壓制了miR-200c的功能。因此,提出了一種機制Circ-VMA21吸收miR-200c抑制NPC凋亡,促進ECM合成代謝并抑制ECM分解代謝,并因此延遲了IVDD的進展。

本研究,qRT-PCR,northern blot和FISH檢測在NPC中揭示了豐富的Circ-VMA21。Circ-VMA21是由VMA21基因的第三個外顯子的反向剪接產生的。生物信息學分析發現Circ-VMA21含有多個miR-200c目標位點,經熒光素酶驗證,pull down,RNA結合蛋白免疫沉淀RIP和FISH分析。此外,Circ-VMA21正調節miR-200c靶標的表達mRNA,XIAP。因此,Circ-VMA21對miR-200c的結合位點是證明有效。

(圖6)

點評

(1)研究者完美的規避了circRNA ceRNA研究的弱點,發現的circRNA含有6個miRNA結合位點是該circRNA作為核心作用分子的標配!

(2)circRNA在非癌類疾病是大有可為的,只要找對方向!

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